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知识中心寡核苷酸引物诱变 寡核苷酸引物的作用是什么？在PCR实验中的作用
2019-06-28 18:05:40
来源：朵拉利品网
1, 寡核苷酸引物的作用是什么？在PCR实验中的作用
PCR技术中的引物的本质和作用。引物是一小段单链DNA或RNA，引物可以做为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，在细胞外的条件下，只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。启动子和引物两者的区别：启动子是DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点，决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列。 引物是一小段单链DNA或RNA，引物可以做为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，在细胞外的条件下，只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。启动子是位于结构基因前的非编码区对转录起调控作用的一段DNA序列。引物则是游离于DNA复制的模板链之外的对DNA复制起调控作用的一小段单链DNA或RNA。
2, 怎么设计引物？
选择引物的一般规则设计和选择引物时有5个要素必需注意。1 引物的3′末端不互补 引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3′末端双链的ΔG是0~-2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在-6时只有40%，到-8时少于20%，而-10时，接近于0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应，即使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。2 引物分子内不互补 应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。虽然有些带有发夹环，其ΔG为-3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。3 引物的组分、解链温度和长度 普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实，这是不对的。以人基因组DNA为模板，用81% AT的引物可以产生单一的，专一的，长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的（16~18 mer）的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20~23 mer引物得到40 kb的产物。但是，引物较长时，如果不借助引物选择的计算机软件帮助，就很难确定一对引物是否会形成二聚体，是否有自身互补性以及专一性如何。于是，用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板，得出非专一产物。 4 引物的内部稳定性 在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定（如GC含量较多），而3′末端不太稳定（如AT含量较多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产物的质量还取决于模板（底物的复杂性、Tm、产物长度）和退火的温度与时间。所以，有时3′末端稳定的引物也可以满意地进行反应。但是，无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于-9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。5 引物的唯一性 为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。虽然不会整个引物序列都偏好于和模板中的一个以上位点匹配，但是，通常见到的引物的3′末端往往都有6~7个没有什么个性的核苷酸。如果假引发的位点正好在放大区的内部，那麻烦就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或杂交效率，就容易产生非专一产物。如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物（如—AAAAAA—）和二核苷酸重复（如—ATATAT—）。
相关概念
引物
引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。
DNA
脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，缩写为DNA）又称去氧核糖核酸，是一种最重要的生命基础分子，可组成遗传指令，以引导生物遗传、生物发育与生命机能运作。 主要功能是长期性的信息储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的信息，是建构细胞内其他化合物的最终源头。带有遗传信息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传信息的表达。DNA是一种长链聚合物，其基本组成单位称为核苷酸，其中的脱氧核糖与磷酸借由酯键相连，组成DNA长链的骨架。每个糖单位都会与某一种碱基相连，组成生物界DNA的碱基主要有四种，分别称为A、T、C、G，这些碱基沿着DNA长链排列，形成的序列，即是遗传信息，用以指导RNA的合成，进而指导蛋白质的合成。
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