寡核苷酸合成寡核苷酸和蛋白结合方式

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寡核苷酸合成寡核苷酸和蛋白结合方式

2019-06-28 18:04:58 来源：朵拉利品网

1, 寡核苷酸和蛋白结合方式

核蛋白
核蛋白nucleoprotein
结合蛋白质中的一类。普遍存在于各种生物的细胞核中的特殊形态的蛋白质，由核酸与组蛋白、精蛋白等的碱性蛋白结合而成为细胞核的主要成分。根据核酸种类不同，可分为核糖核酸核蛋白和脱氧核糖核酸核蛋白。可从细胞核中提取得到，能溶解于1mol/L NaCl溶液中。核蛋白中的蛋白质包括组蛋白（或精蛋白）和非组蛋白蛋白质。组蛋白含碱性氨基酸如精氨酸、赖氨酸等丰富的碱性蛋白，带正电荷。精蛋白仅出现于真核细胞中，含较多的天门冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸，是酸性蛋白，带负电荷。
一类由蛋白质和核酸结合而成的复合蛋白质。存在于一切生物。病毒是一类极简单的生物，它们的化学本质就是核蛋白。细胞中核蛋白主要存在于染色体和核糖体中。由于核酸有DNA和RNA两类，核蛋白也因而分为DNA-核蛋白和RNA-核蛋白两类。DNA-核蛋白主要存在于细胞核内，RNA-核蛋白主要存在于核糖体中。两类核蛋白的许多理化性质相似，都能被碱性染料染色，都不稳定，在热或碱的作用下易分解为核酸及蛋白质。DNA-核蛋白的粘性较强，不溶于等渗食盐溶液，溶于离子强度极低的盐溶液；RNA-核蛋白能溶于等渗食盐溶液。组成核蛋白的蛋白质部分主要是组蛋白和精蛋白等碱性蛋白，也有其他蛋白质如烟草花叶病毒的蛋白质，这种蛋白质分子极大，每个分子由2130条肽链组成，每天肽链的分子量为1.75万。
核蛋白在遗传及蛋白质合成中起着决定性作用，也是生物体内某些病毒和噬菌体的惟一组成成分。
由于核蛋白的核酸与生物遗传和蛋白质生物合成关系密切，因此有关核蛋白结构与功能的研究十分活跃。如烟草斑纹病毒、小儿麻痹症病毒、流行性感冒病毒等动植物病毒本身就是核蛋白，因此核蛋白的研究在动、植物病害的防治及临床医学上有十分重要意义。

2, DNA合成仪的使用方法操作步骤

以亚磷酰胺寡核苷酸合成为例介绍该类仪器的一般操作步骤。亚磷酰胺DNA合成的试剂有：保护碱基的5/—DMT,A、G、C、T亚磷酰胺单体，四唑偶联催化剂，乙酐，N—甲基咪唑封闭试剂，三氯乙酸（TCA）脱保护溶液，12氧化混合物，乙腈清洗溶剂，氨水切除溶液。使用步骤如下：
1）仔细检查合成仪上所有试剂瓶中的试剂量，必要时换掉试剂瓶，特别注意乙腈的量，因为该溶剂用量较大。
2）将标记好的清洁的收集瓶装在合成仪上。
3）将要合成的DNA序列输入合成仪。
4）检查选择的合成步骤是否正确。
5）选择结束方法：TritylOffAuto是仪器的原始状态，若打算以5，—DMT基团连接纯化寡核苷酸，将其转变为TritylOnAuto结束状态。
6）选择结束方法，一般为系统的原始状态。
7）在每个柱监视器的Username下，输入你所希望的保存名字。
8）以代码代替相应的DNA序列标记每一个收集瓶。
9）打印出每一个柱设置的详细资料。
10）检查打印出来的资料是否正确。
11）运行StartColumn步骤检查每一个柱的位置，确保合成仪上合成柱处于正确的位置。
12）检查连接在合成仪上的溶剂残留（废液瓶）是否充满。
13）如果分部收集器用来收集每个DMT脱保护步骤的流出物，确保试管充分清洁干净，并打开分部收集器，确保DMT废液管路通向分部收集器。
14）启动循环，运行开始程序清洗试剂管路，除去原来的试剂。
注意：TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5"端核苷酸带有一个DMT，并将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5"端核苷酸带有一个DMT，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中；TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中。

影响DNA合成的实验结果的因素
1、偶联效率对总产量的影响
无论采用何种纯化方法，从一个失败的合成中得到纯的寡核苷酸是不可能的。可以用分光光度法测定495nm的吸光度来准确地计算出合成的偶联效率，这是由于每个循环中末端核苷酸5"—OH的脱保护产生橘黄色吸收，这种颜色产生于DMT阳离子的释放，对测定每一步的偶联效率非常有用。
在一个成功的合成中，从一个循环到下一个循环间，由于不完全偶联和未反应链的封闭所引起的颜色强度的下降非常小。偶联效率愈高，产率愈高，一定偶联率下，随着片段的延长，寡聚脱氧核苷酸的每步得率逐步下降。
采用优质的试剂，在设计合理的DNA自动合成仪上平均偶联率可以达到99.5%，且仍有余地增加寡核苷酸合成的偶联率。如果日常平均偶联率可达到99.5%以上，DNA链的合成可超过200个核苷酸。
2、固相寡核苷酸合成的局限性对总产量的影响
虽然DNA合成效率高，但是杂质不可避免地要积累。合成一个20mer的寡聚脱氧核苷酸，要包含100多个单独的化学步骤，每一步骤都有产生不必要的副反应的可能性。除了不完全的偶联所引起的失败片段的积累，去嘌呤化后的寡核苷酸链切除也可产生截去末端的片段。
有时会出现碱基杂环的化学修饰，修饰的寡核苷酸产物可能是诱变剂，在生物学实验中容易引起严重的问题。由于副反应的出现，要得到很高纯度的寡核苷酸，必须应用很好的纯化方法进行纯化。

1, 寡核苷酸和蛋白结合方式

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